Развитие отечественного АПК является одним из приоритетных направлений для нашей страны. Поэтому надеемся, что материалы публикуемые в журнале внесут достойный вклад в успешное развитие научного поиска, повышение значимости научных разработок, подъем сельскохозяйственного производства
 д. с.-х. н., профессор А.В.Алабушев

 

№3 2010

№2 2010

№1 2010

№6 2009

№5 2009

№4 2009

№3 2009

№2 2009

№1 2009

 

 

Теоретический и научно-практический журнал ISSN 2079-8733

ГЕНЕТИКА

УДК 575.113.2: 577.112.82

Генетический полиморфизм амилолитических ферментов зерна пшеницы и генетика ферментов биосинтеза крахмала

М. М. Копусь, Н. Г. Игнатьева, Н. Е. Васюшкина,
Н. С. Кравченко, Е. М. Копусь,
Всероссийский научно-исследовательский институт зерновых культур им. И.Г. Калиненко


Рассмотрены значение амилолитических ферментов, являющихся ключевыми гидролитическими ферментами зерна. Освещена роль крахмала, как основного компонента пшеничной муки, определяющую технологические и хлебопекарные свойства пшеницы.
It is considered a role of amylolytic enzymes in a grain ripening and germinating process. It is substantiated a necessity of starch genetics studying for selection improvement and sort variety according to quality.

Ключевые слова: Крахмал, зерно, пшеница, амилолитические ферменты, генетика, вакси, глиадины, нуль-аллели, локусы.
Key words: wheat, starch, amylolytic enzymes, polysugar, genes, alleles.

Генетика ферментов, контролирующих биосинтез крахмала в зерне пшеницы. Содержание крахмала в зерне пшеницы составляет 67–72% в а. с. веществе. В условиях Дона у местных сортов размах меньше, но также это основной компонент зерна. Прежде всего, крахмал источник энергии для прорастающего зерна. По химической структуре это полисахарид, основой которого является молекула
D-глюкозы, и находится в форме α-D-глюко-пиранозы [1].
В состав крахмала входят два основных гомополимера D-глюкозы: амилоза и амилопектин. Амилоза составляет 20–25% массы крахмала и 70–75% амилопектин.
Амилоза – разветвлённый линейный полимер (1000–10000 остатков глюкозы). В её молекуле глюкозидные остатки соединены между собой α-1,4 соединениями.
Амилопектин имеет выше степень полимеризации (100000–10000000 остатков глюкозы) и молекулярной организации. Примерно 5% глюкозидных остатков в молекулярной структуре амилопектина имеют между собой α-1,6 связи, за счёт чего образуются разветвления в цепи полимерной молекулы.
Крахмал накапливается в специализированных органеллах клетки – амилопластах. Образование крахмальных гранул начинается через 4–5 дней после цветения и оплодотворения. В зерне пшеницы отличают по размерам три основных типа крахмальных гранул:
тип А – 15–35 микрон, тип В – 5–10 микрон, и тип D – меньше 2 микрон [2].
Метаболический путь синтеза крахмала в эндосперме злаков является уникальным, и требует участия некоторых специфических изоформ ферментов, которые не присутствуют ни в каких других тканях злаков, где синтезируется крахмал, и ни в тканях других незлаковых видов растений [1].
Сложная структура крахмала свидетельствует о том, что в его синтезе принимает участие комплекс генов, которые контролируют все системы ферментов, катализирующие разные трансформации мономера глюкозы в сложный полисахарид-крахмал.
Первым этапом на пути синтеза крахмала является образование АДФ-глюкозы из молекулы глюкозо-1-фосфата и АТФ под действием фермента АДФ-глюкозопирофосфорилазы (АГФ-азы). Гены, контролирующие синтез этого фермента локализованы в длинных плечах хромосом гомеологической группы (7А, 7В, 7D).
Не менее четырех классов ферментов-синтетаз принимают участие в биосинтезе крахмала в эндосперме пшеницы и других злаков: GBSS (связанные с крахмальными гранулами синтетазы-GBSSI и GBSSII), синтетазы крахмала (SSI, SSII, SSIII), ферменты разветвления цепи крахмала (BEI, BTIIa, BTIIb), и ферменты де-разветвления цепи крахмала (DBE).
Фермент GBSS – ключевой фермент синтеза амилозы. Мутации генов, кодирующих синтез этого фермента, приводят к появлению признака воскоподобного эндосперма, известного под названием вакси. Результатом таких мутаций является полное блокирование фермента GBSS и, соответственно, полное блокирование синтеза амилозы. Такие мутации были идентифицированы вначале у кукурузы, риса, ячменя, сорго, овса и амаранта и только потом у пшеницы [3].
Биосинтез амилопектина осуществляют ферменты-синтетазы крахмала: SSI, SSII, SSIII. Гены, которые кодируют биосинтез фермента SSI, локализованы в коротких плечах хромосом гомеологической группы 7 (7А, 7В, 7D). Синтетазы группы SSII представлены тремя протеинами молекулярной массой 100, 108 и 115 кДа и также контролируются генами, локализованными в коротких плечах хромосом 7 гомеологической группы [4]. Генетический контроль синтетазы SSIII еще окончательно не изучен из-за сложности гомеологических отношений у пшеницы.
Ферменты ветвления полиглюкозидной цепи осуществляют реакцию блокирования
α-1,4 связи, и вместе нейтрализуют ответвление молекулярной цепи крахмала (амилопектина) через α-1,6 глюкановую связь.
Фермент ветвления цепи крахмала ВЕ1 имеет молекулярную массу 88 кДа. Гомологичные гены, его кодирующие, локализованы дистально в длинных плечах хромосом 7 гомеологичной группы. Ген, кодирующий синтез другой изоформы фермента ВЕ1, локализован в длинном плече хромосомы 1D [5]. Энзим ВЕII имеет молекулярную массу 85 кДа, но локализация генов, кодирующих его, пока не установлена.
Роль ферментов де-разветвления цепи крахмала DBE заключается в блокировании образования избыточных α-1, 6 глюкановых связей в молекуле амилопектина, и таким образом, окончательном образовании молекулярной структуры амилопектина. Известны и другие ферменты, принимающие участие в биосинтезе крахмала: гексокиназы, инвертазы, изоамилазы, фосфорглюкомутазы, пуллюланазы и другие.
Генетика вакси (Waxy-Wx): направления использования. Главный фермент GBSSI (около 60 кДа) еще называется вакси (Wx)-протеин и является ключевым ферментом, отвечающим за синтез амилозы. Wx-протеины, или GBSS, кодируются генами с названиями – вакси (Wx) генами. У пшеницы идентифицированы три гомеологичных гена: Wx-А1 (хромосома 7АS-короткое плечо), Wx-В1 (7ВL-длинное плечо) и Wx-D1 (7DS-короткое плечо) [6]. Пшеница, у которой соединение трех неактивных нуль-аллелей этих генов приводят к полному блокированию синтеза фермента GBSS и амилозы, и называется вакси.
Впервые нуль-аллели были выделены и описаны в нашей стране по клейковинным белкам – глиадинам [7, 8] еще в 1977 году.
Объяснение природы пшеницы вакси лежит в области биохимической генетики. Каждый Wx-ген имеет два аллеля: активный аллель, кодирующий синтез определенного Wx-протеина, и неактивный, или нуль-аллель, который блокирует синтез Wx-протеина. Каждый из этих типов Wx-аллелей можно идентифицировать с помощью SDS-электрофореза Wx-протеинов или методами ПЦР – анализа.
Среди сортов пшеницы мировой коллекции были найдены разные комбинации активных и неактивных Wx-аллелей. Каждый неактивный Wx – нуль – аллель вызывает снижение до определенного уровня содержания амилозы в крахмале и меняет соотношение амилоза/амилопектин в зерне. Объединение всех трех неактивных нуль-аллелей в одном сорте пшеницы приводит к полному блокированию амилозы в крахмале. Это и будет пшеница вакси, где крахмал состоит из одного только амилопектина. Пшеница с одним или двумя Wx – нуль – аллелями имеет частично блокированный синтез амилозы и называется частично – вакси (partial Waxy).
Для практической идентификации пшеницы вакси можно использовать йодную пробу (0,2% элементарного йода и 2% KJ). Тестирование – при помощи инфракрасного анализатора, калиброванного по содержанию амилозы (показатель «число падения»). Все три нуль-аллеля не равноценны по их действию на содержание амилозы в крахмале. Самое большое снижение амилозы обусловливает нуль-аллель гена Wx-B1 в сравнении с нуль-аллелями: Wx A1 и Wx-D1 [9].
Соотношение амилоза/амилопектин в пшеничном крахмале имеет большое значение для технологических свойств крахмала и муки пшеницы. Крахмал пшеницы вакси с нулевым содержанием амилозы очень чувствителен к механическому действию рабочих органов мельниц. Разрушение крахмальных гранул крахмала, в соответствии с законами геометрии, увеличивает площадь поверхности, что приводит к повышению водопоглотительной способности (ВПС%) и амилолитической активности муки. Повышение ВПС% муки дает «припек» хлеба. То есть увеличивает весовой выход продукта, а более активный амилолиз увеличивает объем испеченного хлеба. Для производства хлеба это существенные экономические выгоды: 56–58% ВПС у обычных пшениц и 75% у вакси (разница 19–17%). Объясняют это тем, что за короткое время амилаза муки пшеницы вакси активно гидролизует крахмал до низкомолекулярных сахаридов, создавая этим благоприятные условия для высокой активности дрожжей в тесте. Через это мука пшеницы вакси характеризуется высокими показателями газообразующей способности и подъемной силы теста. Следует обратить внимание на то, что такой важный для качества хлеба показатель, как «число падения» или индекс Хагберга, у пшеницы вакси, выращенной и собранной в нормальных условиях, колеблется в пределах 67–80 с. (!). Такое низкое «число падения» бывает у хлебопекарных пшениц только в условиях критического прорастания зерна на корню. В обычных условиях «число падения» для хлебопекарной пшеницы бывает в пределах 350–400 с. (рисунок).


Scan0061

Рис. Влияние добавки муки вакси на объем хлеба из муки сорта Украинка:
1–100% мука сорта Украинка; 2 – добавка 10%; 3–20%; 4–30%.
ЧП-число падения


Другим очень важным направлением использования сортов вакси – получение высококачественной лапши, особенно для стран Японии, Индии, Китая, всей Юго-Восточной Азии (а это 3 млрд человек), где этот продукт питания является традиционным. Крахмал пшеницы вакси имеет те физические свойства, которые необходимы для изготовления качественной лапши: выше уровень набухания и плотности суспензии крахмала, выше температура желатинизации крахмала и энтальпии. Лапша, изготовленная из пшеницы вакси, лучше набухает, имеет повышенную эластичность и упругость, лучшие вкусовые качества и товарный вид. Исследования показали, что тесто, изготовленное из пшениц вакси, лучше выдерживает режим замораживания – оттаивания. А это открывает перспективы изготовления продуктов из замороженного теста, таких как круассаны, продукты из слоеного теста, вареники, пельмени, гамбургеры и другое.
Еще одно перспективное направление использования пшениц вакси – производство биоэтанола. Если сорта обычной пшеницы могут дать из тонны зерна 350–450 л чистого этанола, то проведенные в последние годы исследования показали, что самая высокая эффективность трансформации крахмала в биоэтанол (650л/т) наблюдалась у генетических линий вакси с аномальным составом крахмала: нулевым содержанием амилозы. Умножив разницу на сотню тысяч тонн перерабатываемого сырья, получим цифры, которые заставят задуматься над эффективностью переработки зерна в этиловый спирт.
Генетический полиморфизм амилолитических ферментов зерна пшеницы. В зерне пшеницы присутствует два специфических фермента, которые осуществляют гидролиз крахмала:

  • α-амилаза, или α–1,4–глюкангидрола-за, она гидролизует α–1,4–глюкановые связи крахмала и родственные ему углеводы до низкомолекулярных декстринов и частично мальтозы. Тривиальное название фермента – декстриногенамилаза. α-амилаза – фермент зерна, которое прорастает. Он не стойкий в водных незабуференных растворах. Ионы кальция способны стабилизировать гидрологическую функцию α-амилазы. Фермент инактивируется при низких значениях рН. α-амилаза достаточно термостабильный фермент и не теряет активности при температуре выше 70ºС.
  • β-амилаза, или α-1,4–глюканмальто-гидролаза, она гидролизует α-1,4–глюкановые связи крахмала, последовательно отсоединяя (экзофермент) остатки мальтозы от нередуцированных концов полимерного звена молекулы полисахаридов. В результате гидролиза крахмала образуется β-мальтоза. Тривиальное название фермента – сахарогенамилаза. В зерне пшеницы β-амилаза находится в неактивном или связанном – S-S-cвязями с молекулами глютенинов. В процессе созревания зерна активная β-амилаза постепенно инактивируется и переходит в латентное состояние.

Изоэлектрическое фокусирование позволило идентифицировать у сорта Чайниз Спринг больше 30 изомеферментов, контролируемых двумя локусами: α-Amy-1 и α-Amy-2. Локус: α-Amy-1 конролирует синтез не мененее 17 изоэнзимов с изоэлектрическими точками в градиенте рН 6,0–7,5. Локус α-Amy-2 кодирует 16 изоэнзимов с изоэлектрическими точками: рН 4,9–6,0. Локус α-Amy-1 представлен серией генов, расположенных в длинных плечах хромосом гомеологической группы 6, тогда как локус α-Amy-2 имеет серию генов, расположенных в длинных плечах гомеологичной группы 7[10].
Изоамилазы, контролируемые локусом
α-Amy-1, синтезируются в зерне пшеницы, которое прорастает, и получили название «солодовых» (malt) α-амилаз. Тогда как α-ами-лазы, контролируемые локусом α-Amy-2, синтезируется как в прорастающем зерне, так и на ранних фазах развития и формирования зерновки. Эта группа изоферментов α-амилазы называеся «зелеными» (green) α-амилазами.
У сорта Чайниз Спринг было идентифицировано около 33 изоферментов β-амилаз с изоэектрическими точками в пределах рН 4,6–5,5. Генетический контроль β-амилаз осуществляют два локуса: β-Amy-1 и β-Amy-2. Локус
β-Amy-1 расположен в длинных плечах хромосом 4А (локус β-Amy-А1) и 4D (локус
β-Amy-D1). Локус β-Amy-2 находится в длинном плече хромосомы 5А (локус β-Amy-A2). У локуса β-Amy A1 идентифицировано два аллеля, у локуса β-Amy D1 – пять аллелей, и два аллеля идентифицировано в локусе β-Amy-A2.
Никаких данных в отношении связи локусов, контролирующих состав α- и β-амилаз зерна пшеницы с какими-либо признаками качества муки в цитируемых работах найдено не было.

ЛИТЕРАТУРА

  • James M., Denyer K., Myers A. Starch synthesis in the cereal endosperm. // Currrent Opinion in Plant Biol. – 2003. – Vol. 6. – P. 215–222.
  • Bechtel D., Zayas I., Kaleikau L., Pomeranz J. Size distribution of wheat starch granules during endosperm development // Cereal Сhem. – 1990. –
    Vol. 67. – P. 59–63.
  • Nakamura T. Jamamori M., Hirano H., Hidana S., Nagamine T. Production of waxy (amylase-free) wheat // Mol. Gen. Genet. – 1995. – Vol. 248. –
    P. 253–259.
  • Jamamori M., Selection of wheat lacking a putative enzyme for starch synthesis, SGP-1 // Proc. 9–tk Jntl. Wheat Genet. Symp. – 1998. – Vol. 4. –
    P. 300–302.
  • Nagamine T., Joshida H., Komae K. Varietal differences and chromosome locations of multiple isoforms of starch branching enzumes in wheat endosperm // Phytochem. – 1997. – Vol. 46. – P. 23–26.
  • Chao S., Sharp P., Worland E., Koebuer R., Gale M. RELP-based genetic map of wheat homeologous group 7 chromosomes // Teor. Appl. Genet. – 1989. Vol. 78. – P. 495–504.
  • Cозинов А. А., Копусь М. М. Мутация глиадинокодирующего локуса хромосомы 1D // Цитология и генетика. – 1983. – Т.17. – №2. – С.19–24.
  • Kопусь М. М. Супермутант компонетного состава глиадина мягкой пшеницы (эффект «пустого» геля). // Докл. ВАСХНИЛ. –1987. – №1. С.5–6.
  • Takata K., Nishio Z., Iriki N., Tabiki T., Funatsuki W., Jamaushi H. Comparison of guality characteristies of Waxy wheat using a near isogenic line // Breeding Scince. – 2005. – Vol. 55. – P. 87–92.
  • Ainsworth C., Doherty P., Edwards K., Martienssen R., Gale M. Allelie variation of α-amylase loci in hexaploid wheat // Teor. Appl. Genet.1985. –Vol. 70. – P. 400–406.

 

© 2009 ГНУ ВНИИЗК
им. И.Г.Калиненко
Главная | Поиск | Авторам | Контакты | Архив