Развитие отечественного АПК является одним из приоритетных направлений для нашей страны. Поэтому надеемся, что материалы публикуемые в журнале внесут достойный вклад в успешное развитие научного поиска, повышение значимости научных разработок, подъем сельскохозяйственного производства
 д. с.-х. н., профессор А.В.Алабушев

 

№3 2010

№2 2010

№1 2010

№6 2009

№5 2009

№4 2009

№3 2009

№2 2009

№1 2009

 

 

Теоретический и научно-практический журнал ISSN 2079-8733

УДК 581.1

БИОТЕХНОЛОГИЯ И ОЦЕНОЧНЫЙ ЭТАП СЕЛЕКЦИИ РИСА

Костылев П.И.

Всероссийский научно-исследовательский институт зерновых культур им. И.Г. Калиненко, г. Зерноград

Достижения в биотехнологии риса повышают эффективность его селекции. Культура пыльников необходима селекционерам для сокращения времени на создание сортов риса, фиксирования рекомбинаций и преодоления бесплодия отдаленных гибридов. Дигаплоидные популяции важны для нанесения на карту генов агрономических признаков, включая QTL. Молекулярные маркеры привели к выявлению генов устойчивости к биотическим и абиотическим стрессам. MAS стала важным инструментом в селекции риса для перемещения генов от одного сорта к другому, для их пирамидирования и выведения длительно стойких к вредителям сортов. Клонирование на основе картирования позволило выделить полезные гены, управляющие важными агрономическими признаками, и объединить эти гены в элитных сортах риса посредством трансформации. Идентификация генов и манипуляции с ними представляют крупное достижение в генетике и селекции риса.

Селекция риса состоит из двух этапов: эволюционного, когда создаются разнообразные популяции, и оценочного, когда отбираются генотипы–родоначальники новых сортов. В клеточной и молекулярной биологии, биотехнологии риса разработаны новые методы для повышения эффективности селекции. На оценочном этапе значительно повышается эффективность отбора.
Культура пыльников. В 1968 году были получены гаплоиды из культуры пыльников риса. С тех пор методы культуры пыльников были существенно улучшены. Культура пыльников имеет большое значение для получения чистых селекционных линий из промежуточных поколений любой расщепляющейся популяции. Такое производство значительно короче цикла селекции новых сортов. Селекционная эффективность дигаплоидных (ДГ) линий значительно больше. Дигаплоидные линии также полезны для создания популяций, необходимых при генетическом картировании методами молекулярного анализа. У риса картированные популяции ДГ-линий, полученных методом культуры пыльников гибридов indica x japonica, в настоящее время используются в молекулярном картировании генов локусов количественных признаков (QTL) [1].
Много сортов и улучшенных селекционных линий было получено на основе культуры пыльников в Китае, Корее, Японии и США. В IRRI метод культуры пыльников используется для получения дигаплоидных линий от многих скрещиваний для разных целей селекции риса. На Филиппинах этим методом был выведен сорт PSBRc50. Многие ДГ-линии, полученные в культуре пыльников, в настоящее время используются в качестве родителей в селекционных программах. ДГ-линии были использованы для преодоления стерильности у потомков межвидовых гибридов О. sativa х O.glaberrima [2].
Технологии молекулярных маркеров. Одним из самых интересных событий в области биотехнологии риса является появление молекулярных маркеров. Созданы серии молекулярных маркеров, например RFLP, RAPD, AFLP, и микроспутники. Эти маркеры открывают новые возможности для различных исследований в области генетики и селекции, особенно конструирование насыщенных молекулярных карт, генные метки, картирование QTL, маркерная селекция, пирамидирование генов, физическое картирование генома, клонирование генов на основе карт, интрогрессия чужеродных генов и ДНК-фингерпринтинг популяций патогенов [3].
Молекулярные карты. Наличие всеобъемлющих молекулярных генетических карт риса, включающих более 2300 ДНК маркеров, отражает основные достижения генетики риса. Молекулярная генетическая карта риса на основе RFLP была разработана в Корнельском университете (Итака, США) совместно с IRRI [4]. Эта карта основана на популяции F2, полученной от скрещивания indica х japonica и картированные  последовательности были клонированны из геномной библиотеки, полученной из indica сорта IR-36. Позднее в карту были добавлены многие новые маркеры. Всеобъемлющая молекулярная генетическая карта, состоящая из 2275 маркеров ДНК, была разработана в рамках Программы исследований генома риса в Японии [1].
Селекция с помощью молекулярных маркеров (МАS). Многие гены, имеющие экономическое значение, например, устойчивости к болезням и насекомым, постоянно переходят от одних сортов в другие в ходе селекции. Процесс их передачи занимает много времени.  Оценка генотипов проводится сложными и дорогостоящими методами и требует большого количества полевых площадей. Слежение за такими генами с помощью тесно сцепленных с ними ДНК-маркеров означает, что время и деньги могут быть сохранены при переносе их из одного сорта в другой. Молекулярные маркеры, тесно сцепленные с целевым геном, могут действовать как "метки", которые можно использовать для косвенного отбора генов в селекционных программах.
Генные маркеры риса. Двумя наиболее серьезными и распространенными заболеваниями при производстве риса являются пирикуляриоз (гриб Pyricularia oryzae) и бактериоз (Xanthomonas oryzae pv. oryzae). Выведение сортов с повышенной устойчивостью к этим заболеваниям с помощью технологии молекулярных маркеров находится в центре внимания совместных усилий IRRI и национальных институтов. Ряд генов устойчивости к бактериозу и пирикуляриозу были помечены молекулярными маркерами.
Устойчивость к пирикуляриозу уже давно создает серьезные проблемы в селекционном процессе риса. Резистентность на основе одного гена преодолевается в считанные годы в инфекционных средах. Устойчивость некоторых сортов, однако, оказалась более прочной. В нескольких случаях повышенная устойчивость к пирикуляриозу связана с количественной или полигенной наследственностью. Многие программы улучшения риса в настоящее время направлены на включение количественной или полигенной устойчивости в различные сорта риса. Wang и др. (1994) выявили ген Pi-b, дающий полную устойчивость, а также еще девять регионов генома с количественными эффектами устойчивости к пирикулярии [5]. Последние рассматриваются в качестве предполагаемых QTL для устойчивости к пирикуляриозу. Установлено, что три QTL связаны с генами полной устойчивости.
В совместной работе Мухиной Ж.М. и др. (ВНИИ риса) и Костылева П.И. с коллегами (ВНИИ зерновых культур) по введению генов устойчивости к пирикуляриозу Рi-1, Pi-2, Pi-33 в генотипы отечественных сортов риса Боярин и Вираж, адаптированных к местным агроклиматическим  условиям, в качестве доноров переносимых генов использованы линии C101-lac (L1), C104-lac (L3), C111-lac (L10) (Франция)  подвида indica[6]. Линии были очень позднеспелыми (с вегетационным периодом 140-145 дней) и имели высокую стерильность. При гибридизации российские сорта выступали в качестве отцовских форм. Контроль присутствия донорных генов устойчивости проводили ДНК-маркерами. Визуализацию результатов проводили с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР) и электрофореза. В процессе пирамидирования в 2008 году получены три линии риса, совмещающие в своем генотипе все 3 доминантных локуса Pi в гомозиготном состоянии.
Гены аромата, восстановления фертильности и термолабильной генетической мужской стерильности, резистентность к дельфациде и толерантность к вирусу Тунгро и затоплению были помечены молекулярными маркерами. Маркеры на основе ПЦР (полимеразной цепной реакции) были получены для некоторых из этих признаков, чтобы облегчить селекцию. Nair и др. (1996) разработали на основе ПЦР маркеры для генов резистентности к галловой мошке, Gm2 и Gm4,  полезные в маркерной селекции для создания устойчивых сортов [7]. Ichikawa и др. (1997) разработали маркеры для гена Rf1, восстановителя фертильности [8].
Сейчас упор делается на меченые гены, имеющие важное экономическое значение, путем разработки маркеров на основе ПЦР. Это позволит повысить эффективность маркерной селекции и пирамидирования полезных генов устойчивости к различным биотическим и абиотическим стрессам.
QTL картирование. Хотя ряд важных признаков определяется локусами, оказывающими значительное воздействие на фенотип, наиболее экономически важные признаки, как урожайность, качество и толерантность к различным абиотическим стрессам, имеют в основе количественную природу. Генетические различия, затрагивающие такие признаки, контролируются сравнительно большим числом локусов, каждый из которых может сделать небольшой положительный или отрицательный вклад в окончательное проявление фенотипических признаков. Эти участки называются "локусы количественных признаков" (QTL). Гены, регулирующие такие признаки, называются полигены или мелкие гены – они также подчиняются законам наследования Менделя, но испытывают сильное влияние окружающей среды.
Появление молекулярных маркеров позволило нанести на карту QTL с большим генотипическим влиянием на фенотип. Эти молекулярные маркеры позволяют преобразовать QTL в менделевские или квазименделевские объекты, которыми можно управлять в классических программах селекции. Через анализ сцепления больших расщепляющихся популяций могут быть определены местоположения QTL. Несколько QTL для таких важных в экономическом плане признаков, как устойчивость к пирикуляриозу [9], толерантность к затоплению [10] и компоненты урожая [11], были нанесены на карту с помощью молекулярных маркеров.
Будущие исследования должны сосредоточиться на следующем:

  1. идентификация QTL в различных окружающих средах;
  2. использование комплементарных QTL для выделения трансгрессий при расщеплении, особенно от межвидовых скрещиваний;
  3. идентификация ортологичных QTL среди различных видов, поскольку сохранение таких QTL среди видов может обеспечить новые возможности манипуляции хозяйственно-важными признаками;
  4. высокая разрешающая способность QTL, чтобы определить, являются ли QTL единственными генами или группами тесно сцепленных генов и играет ли сверхдоминирование существенную роль в гетерозисе, а затем клонировать QTL, основываясь на картировании с высокой разрешающей способностью.

Пирамидирование главных генов. Формирование насыщенных молекулярных карт, возможность обнаружения тесного сцепления целевых генов с молекулярными маркерами (типа RFLP) и контроля этих маркеров с помощью ПЦР-анализа обеспечило новые возможности использования маркерной селекции в селекции риса. Протоколы для маркерной селекции, основанной на ПЦР, были разработаны для риса [12]. В маркерной селекции особей, несущих целевые гены, отбирают в расщепляющейся популяции, основываясь на тесно сцепленных маркерах, а не на их фенотипах. Таким образом, популяции могут быть скринированы на ранних стадиях развития растений и в различных условиях среды. Маркерная селекция помогает преодолеть интерференцию от взаимодействий между различными аллелями или различными локусами. Маркерная селекция (MAS) увеличивает эффективность и точность отбора, особенно для признаков, которые трудно определяются по фенотипу. Ее применяли для пирамидирования четырех генов устойчивости к бактериозу (Xa4, xa5, xa13 и Xa21). Пирамидированные линии показали более широкий спектр и более высокий уровень устойчивости, чем линии с единственным геном. Пирамидированные линии с различными генными комбинациями полезны для того, чтобы вывести сорта с длительной устойчивостью. Пирамидированные линии с тремя или четырьмя генами в комбинации показали увеличенный и более широкий спектр устойчивости к бактериозу, чем формы с единственным геном. MAS также обеспечивает новые возможности передачи и объединения QTL в агрономически желательные генотипы. Анализ с помощью молекулярных маркеров используется для идентификации популяции патогенов с широким разнообразием при создании генотипов с длительной устойчивостью.
Клонирование генов на основе карты. Создание молекулярных генетических карт с высокой плотностью и формирование библиотек искусственных минихромосом бактерий (BAC) или дрожжей (YAC) были важными событиями, которые привели к выделению таких генов устойчивости к бактериозу риса, как Xa1, Xa21 и Pib. Используя позиционное клонирование, изолированный ген Xa21 был введен в культурные сорта риса через трансформацию. С помощью такой же стратегии был клонирован ген устойчивости к бактериозу Xa1 [13]. В IRRI BAC библиотека была построена из геномной ДНК сорта IR 64 и состояла из 18 432 клонов. Усилия клонировать гены устойчивости являются очень важными и когда это произойдет, они будут переданы элитным сортам риса посредством трансформации.
Функциональная геномика. Рис стал модельной системой для исследования геномов. Факторы, вносящие свой вклад в эту ситуацию, включают:

  1. относительно небольшой размер генома риса;
  2. синтению его генома с таковыми других хлебных злаков;
  3. пригодность плотно заполненных молекулярных карт, содержащих больше чем 2300 маркеров ДНК;
  4. хорошо характеризованные YAC и BAC библиотеки;
  5. крупномасштабный анализ экспрессии секвенированных меток (EST); обширное количество генетических ресурсов (мутанты, генетический фонд, дикие виды, картированные популяции, интрогрессивные линии);
  6. сравнительная несложность трансформации [14].

ПОТЕНЦИАЛ  БИОТЕХНОЛОГИИ

Достижения в клеточной и молекулярной биологии риса дают новые возможности увеличения эффективности обоих этапов селекции риса: эволюционного и оценочного. Биотехнология становится важным компонентом селекции риса. Культура пыльников стала важной методикой для селекционеров, позволяющей сократить время для создания сортов риса, фиксировать рекомбинации и преодолеть бесплодие отдаленных гибридов. Несколько сортов риса были выведены посредством культуры пыльников. Дигаплоидные популяции важны для того, чтобы нанести на карту гены, контролирующие агрономические признаки, включая QTL.
Молекулярные маркеры привели к выявлению многих генов устойчивости к главным биотическим и абиотическим стрессам. MAS стала важным инструментом в селекции риса для перемещения генов от одного сорта к другому, для их пирамидирования и выведения длительно стойких к вредителям сортов риса. Клонирование на основе картирования позволило выделить полезные гены, управляющие важными агрономическими признаками, и объединить эти гены в элитных сортах риса посредством трансформации.
Прогресс в генной инженерии облегчил введение новых клонированных генов в геном риса через трансформацию. Был создан трансгенный рис с расширенной устойчивостью к болезням и насекомым и улучшенными пищевыми качествами, который будет иметь большое значение для увеличения объемов производства риса. Усилия в секвенировании генома риса добавили новые данные для исследований в функциональной геномике, чтобы точно показать функцию генов риса. Идентификация генов и манипуляции с ними представляют крупное достижение в генетике и селекции риса. Много сортов риса были выведены с помощью методов биотехнологии. Будущее питание и продовольственная безопасность будут зависеть от сортов риса с высоким потенциалом урожайности, устойчивостью к биотическим и абиотическим стрессам и более высоким уровнем питательных веществ в зерне. Селекционные методы и инструменты биотехнологии помогут решить эти проблемы.

ЛИТЕРАТУРА

  1. Harushima, Y., Yano, M., Shomura, A., Sato, M., Shimano, T., et all. 1998. A high density rice genetic linkage map with 2275 markers using a single F2 population. Genetics, 148: 479-494.
  2. Enriquez, E., Brar, D.S., Rosario, T.L., Jones, M. & Khush, G.S. 2000. Production and characterization of doubled haploids from anther culture of the F1s of Oryza sativa L. x O. glaberrima Steud. Rice Genet. Newsl., 17: 67-69.
  3. Mohan, M., Nair. S., Bhagwat, A., Krishna, T.G., Yano, M., Bhatia, C.R. & Sasaki, T. 1997. Genome mapping, molecular markers and marker-assisted selection in crop plants. Mol. Breed., 3: 87-103.
  4. McCouch, S.R., Kochert, G., Yu, Z-H., Wang, Z-Y., Khush, G.S., Coffman, D.R. & Tanksley, S.D. 1988. Molecular mapping of rice chromosomes. Theor. Appl. Genet., 76: 815-829.
  5. Wang, Z-X., Yano, M., Yamanouchi, U., Iwamoto, M., Monna, L., Hayasaka, H., Katayose, Y. & Sasaki, T. 1999. The Pi-b gene for rice blast resistance belongs to the nucleotide binding and leucine-rich repeat class of plant disease resistance genes. Plant J., 19: 55-64.
  6. Костылев П.И., Вожжова Н.Н., Мухина Ж.М., Ильницкая Е. Т., Перенос генов устойчивости к пирикуляриозу в сорта риса с помощью маркерного контроля. Устойчивое производство риса: Мат-лы Междунар. науч.-практ. конф. ВНИИ риса. - Краснодар, 2006. - С.121-130.
  7. Nair, S., Kumar, A., Srivastava, M.N. & Mohan, M. 1996. PCR-based DNA markers linked to a gall midge resistance gene Gm4t has potential for marker aided selection in rice. Theor. Appl. Genet., 92: 660-665.
  8. Ichikawa N., Kishimoto N., Inagaki A., Nakamura A., Koshino, Y., Yokozeki Y., Oka M., Samoto S., Akagi H., Higo K., Shinjyo C., et all. 1997. Arapid PCR-aided selection of a rice line containing the Rf1 gene which is involved in restoration of the cytoplasmic male sterility. Mol. Breed., 3: 195-202.
  9. Wang, G.-L., Mackill, D.J., Bonman, J.M., McCouch, S.R. & Nelson, R.J. 1994. RFLPmapping of genes conferring complete and partial resistant to blast in a durably resistant rice cultivar. Genetics, 136: 1421-1434.
  10. Nandi, S., Subudhi, P.K., Senadhira, D., Manigbas, N.L., Sen-Mandi, S. & Huang, N. 1997. Mapping QTLs for submergence tolerance in rice by AFLP analysis and selective genotyping. Mol. Gen. Genet., 255: 1-8.
  11. Xiao, J., Li, J., Grandillo, S., Ahn, S.N., Yuan, L., Tanksley, S.D. & McCouch, S.R. 1998. Identification of trait-improving quantitative trait loci alleles from a wild rice relative. Genetics, 150: 899-909.
  12. Zheng, K., Huang, N., Bennett, J. & Khush, G.S. 1995. PCR-based marker-assisted selection in rice breeding. Manila, Philippines, IRRI,  No. 12, 24 pp.
  13. Yoshimura, S., Yamanouchi, U., Katayose, Y., Toki, S., Wang, Z-X., Kono, I., Kurata, N., Yano, M., Iwata, N. & Sasaki, T. 1998. Expression of Xa1, a bacterial blight resistance gene in rice, is induced by bacterial inoculation. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 95: 1663-1668.
  14. Khush, G. S. & Brar, D.S. 1998. The application of biotechnology to rice. In Ives, C. & Bedford, B. eds. Agricultural biotechnology in international development, p. 92-121. Wallingford, UK, CAB International.

 

© 2009 ГНУ ВНИИЗК
им. И.Г.Калиненко
Главная | Поиск | Авторам | Контакты | Архив